Фототерапия.ru - Всё о фототерапии и оборудовании для неё

В патогенезе ограниченной склеродермии большое значение придаётся различным иммунным нарушениям, выявляемым как в крови, так и в коже больных [1-3]. Вместе с тем роль клеточно-опосредованных иммунных реакций в формировании патологического процесса в очагах поражения окончательно не установлена. Известно, что клеточная инфильтрация кожи лимфоцитами, плазматическими клетками и гистиоцитами является одним из ранних признаков склеродермии. Некоторые исследователи рассматривают наличие в инфильтратах кожи плазматических клеток как подтверждение важной роли в развитии заболевания В-клеточного звена иммунной системы, однако другие авторы ведущую роль отводят активации Т-клеточных иммунных реакций [4, 5].

Существующие методы терапии ограниченной склеродермии недостаточно эффективны, что обусловливает поиск более совершенных терапевтических подходов. В последние годы в клиническую практику предложен новый эффективный метод лечения склеродермоподобных заболеваний, основанный на облучении кожи больных длинноволновым ультрафиолетовым светом УФА-1 диапазона (340-400 нм) [6-9], Установлено, что одним из основных механизмов действия УФА-1 излучения на склеротические изменения кожи является увеличение количества интерстициальной коллагеназы - матричной металлопротеиназы ММР-1, вызывающей деградацию коллагена [10-12]. В то же время механизмы действия этого вида излучения на иммунное воспаление в коже остаются невыясненными.

Целью настоящей работы явилось изучение содержания в пораженной коже больных ограниченной склеродермией основных субпопуляций Т-клеток: CD4+ и CD8+ лимфоцитов, активированных CD25+ и HLA-DR+ клеток, а также оценка динамики данных показателей под действием ультрафиолетовой терапии УФА-1 диапазона.

Материал и методы

Материалом для исследования служили иммуногистохимические препараты кожи 10 здоровых добровольцев (контрольная группа) и 17 больных ограниченной склеродермией (12 женщин и 5 мужчин) в возрасте от 18 до 63 лет (медиана 34 года), с продолжительностью болезни от 5 мес. до 17 лет (медиана 1,5 года). У 16 больных диагностирована бляшечная форма заболевания, у 1 - линейная форма. У всех пациентов очаги склеродермии находились в стадии эритемы и индурации. У 10 больных исследования препаратов кожи проведены до и после курса УФА-1 терапии. Группа больных не отличалась по возрасту и полу от группы здоровых добровольцев (р>0,05).

Биоптаты кожи у больных брали до лечения из очагов эритемы и/или индурации кожи, после лечения - из участков ранее поражённой кожи, расположенных рядом с местом предыдущей биопсии. У здоровых добровольцев кожу для исследования забирали при хирургической коррекции косметических дефектов.

Иммуногистохимические исследования проводили на парафиновых срезах по стандартной методике с предварительной обработкой в СВЧ-печи и применением проявляющей системы Novostain super ABC Kit (universal). Для иммунофенотипирования использовали мышиные моноклональные антитела (Novocastra Laboratories Ltd, Великобритания), специфичные к антигенам CD4 - маркеру субпопуляции Т-хелперов/индукторов, CD8 - маркеру субпопуляции супрессорно-цитотоксических Т-клеток, CD25 - маркеру α-цепи рецептора ИЛ-2, HLA-DR - молекуле главного комплекса гистосовместимости II класса. Для определения содержания CD4+ и CD8+ клеток использовали моноклональные антитела, готовые к употреблению; для определения CD25+ клеток антитела применяли в разведении 1:150, HLA-DR+ клеток - в разведении 1:40. Подготовленные препараты изучали в световом микроскопе «Leica DM 4000В», изображение документировали цифровой камерой «Leica DFC 320».

Содержание CD4+, CD8+ и CD25+ клеток в эпидермисе определяли в поле зрения из расчета на 100 эпителиоцитов базального слоя. При оценке содержания CD4+, CD8+ и CD25+ клеток в дерме в 5 периваскулярных инфильтратах произвольно выбирали по 20 клеток, среди которых проводили подсчет количества клеток, меченных указанными антителами, после чего для каждого биоптата рассчитывали средние значения их относительного содержания. Содержание HLA-DR+ клеток определяли с помощью программы «Adobe Photoshop'CS» (версия 8). Для этого в пикселях измеряли площадь поля зрения и площадь окрашенных клеток, затем высчитывали процентное отношение площади окрашенных клеток к площади поля зрения. Подсчет осуществляли в 5 выбранных полях зрения, после чего для каждого препарата рассчитывали среднее значение.

Фототерапию пациентов осуществляли в ультрафиолетовой кабине Waldmann UV 700IK «Herbert Waldmann GmbH & Co. KG» (Германия) с использованием ламп F85/100W-TL10R, генерирующих излучение в диапазоне волн 340-400 нм с максимумом эмиссии на длине волны 370 нм. Облучения начинали с дозы 5-20 Дж/кв.см, последующие разовые дозы повышали на 5-10 Дж/кв.см до максимальной разовой дозы 20-40 Дж/кв.см. Процедуры проводили в виде монотерапии, из дополнительных средств применяли увлажняющий крем.

Для оценки динамики кожного статуса больных в процессе УФА-1 терапии в очагах склеродермии до и после курса лечения определяли площадь индурации кожи (в кв.см), а также интенсивность основных клинических симптомов заболевания - эритемы и индурации кожи, которую выражали в баллах от 0 до 3 (0 баллов - отсутствие признака, 1,2 и 3 балла - соответственно минимальная, средняя и максимальная выраженность признака). При оценке эффективности лечения у каждого пациента в процентах рассчитывали индексы относительного уменьшения указанных клинических признаков, после чего по разработанной нами формуле выводили суммарный индекс уменьшения поражения кожи:

где Ик, Иэ, Ип, Ии - соответственно индексы относительного уменьшения поражения кожи, интенсивности эритемы, площади индурации и интенсивности индурации.

О результатах лечения судили по количеству больных, у которых наступило клиническое выздоровление, значительное улучшение, улучшение или эффект от терапии отсутствовал. Если Ик составлял 95% и более, констатировали клиническое выздоровление, 51-94% - значительное улучшение, 25-50% - улучшение, менее 25% - отсутствие эффекта.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ Statistica 6.1 (StatSoft, Inc., США). Описательную статистику количественных признаков представляли медианами и квартилями (в формате Me [Q1; Q3]), качественных признаков - абсолютными и относительными частотами. Сравнение несвязанных групп по количественным признакам осуществляли с использованием теста Манна-Уитни, по качественным признакам - с помощью точного критерия Фишера. Для сравнения связанных групп применяли тест Вилкоксона. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Исследование иммуногистохимических препаратов кожи показало, что в контрольной группе CD4+ и CD8+ лимфоциты в эпидермисе отсутствовали, а в дерме встречались лишь единичные клетки (рис. 1 а, 2 а). В эпидермисе больных CD4+ лимфоциты также не обнаруживали, тогда как отдельные CD8+ лимфоциты находили в большинстве исследованных препаратов, нередко они располагались вблизи базального слоя эпидермиса в тесном контакте с эпителиоцитами (рис. 2 б). При статистическом анализе установлено более высокое содержание CD8+ лимфоцитов в эпидермисе по сравнению с таковым в группе здоровых добровольцев (табл. 1; р<0,001).


а	б
Рис.1. CD4+ лимфоциты в периваскулярных инфильтратах кожи. х400. Здесь и на рис. 2-4: а - у здоровых добровольцев; б - у больных ограниченной склеродермией


а	б
Рис.2. CD8+ лимфоциты в эпидермисе и периваскулярных инфильтратах кожи. х200 (а); х400 (б)

Таблица 1. Содержание популяций клеток в эпидермисе и периваскулярных инфильтратах кожи здоровых добровольцев и больных ограниченной склеродермией (медианы и квартили)

Популяция клеток	Здоровые добровольцы (n=10)	Больные ограниченной склеродермией (n=17)	p
Эпидермис*
CD8+	0	0,6 (0,2; 1,0)	<0,001
Периваскулярные инфильтраты (%)
CD4+	6,0 (5,0; 8,0)	12,0 (7,0; 19,0)	0,016
CD8+	9,0 (7,0; 13,0)	29,0 (25,0; 34,0)	<0,001
CD4+/CD8+	0,65 (0,60; 0,71)	0,44 (0,30; 0,73)	0,097
CD25+	0	31,5 (27,0; 50,0)**	<0,001
HLA-DR+	1,8 (1,5; 2,4)	7,1 (4,8; 10,4)**	<0,001

Примечание. р - уровень статистической значимости различий при сравнении показателей у здоровых добровольцев и больных с использованием теста Манна-Уитни.
* - Количество окрашенных клеток на 100 эпителиоцитов базального слоя.
** - n=10.

В периваскулярных инфильтратах кожи больных выявлено повышенное содержание как CD4+ лимфоцитов (р=0,016), так и CD8+ лимфоцитов (р<0,001). CD4+ клетки находили лишь в периваскулярных инфильтратах (рис. 1 б), CD8+лимфоциты встречались как в составе периваскулярных инфильтратов, так и в виде отдельных клеток, располагавшихся в сосочковом слое дермы (см. рис. 2 б).

У здоровых добровольцев сумма CD4+ и CD8+ лимфоцитов составляла 15% клеточного состава периваскулярных инфильтратов, тогда каку больных ограниченной склеродермией - почти половину всех клеток (41%). Содержание CD4+ и CD8+ клеток в инфильтратах превышало значения аналогичных показателей в группе здоровых лиц соответственно в 2 и 3,2 раза. Количество CD8+ лимфоцитов в очагах склеродермии было в 2,4 раза выше количества CD4+ клеток, в результате чего отношение CD4+/CD8+ лимфоцитов было пониженным (см. табл. 1).

Реакция к антигену CD25 (рецептору ИЛ-2) в коже здоровых лиц была отрицательной как в эпидермисе, так и в дерме (рис. 3 а). В эпидермисе больных CD25+ клетки также отсутствовали, однако в периваскулярных инфильтратах их количество оказалось значительно увеличенным (см. табл. 1; р=0,005). Положительная реакция наблюдалась в основном в клетках периваскулярных инфильтратов поверхностного сосудистого сплетения, единичные окрашенные клетки встречались среди колла геновых волокон (рис. 3 б).


а	б
Рис.3. CD25+ клетки в периваскулярных инфильтратах кожи. х200 (а); х400 (б)


а	б
Рис.4. HLA-DR+ клетки в эпидермисе и периваскулярных инфильтратах кожи. х400

HLA-DR+ клетки и в группе здоровых добровольцев, и в группе больных выявляли как в эпидермисе, так и в дерме в виде конгломератов клеток с переплетающимися отростками (рис. 4). Различий в количестве HLA-DR+ клеток в эпидермисе в группах здоровых лиц и больных не обнаружено, однако в периваскулярных инфильтратах в группе больных оно почти в 4 раза превышало таковое в контрольной группе (см. табл. 1; р<0,001).

При проведении УФА-1 терапии больные получали на курс от 20 до 40 процедур (медиана 30 процедур). Максимальные дозы облучения варьировали от 20 до 40 Дж/кв.см (медиана 30 Дж/кв.см), курсовые дозы - от 510 до 1939 Дж/кв.см (медиана 648 Дж/кв.см). В результате терапии положительный эффект констатирован у 9 из 10 больных: клиническое выздоровление достигнуто у 1 пациента, значительное улучшение - у 4, улучшение - у 4. В процессе лечения в очагах склеродермии наблюдали уменьшение интенсивности как эритемы (р=0,005), так и индурации кожи (р=0,011); площадь индурации уменьшилась на 22% (р=0,011; табл. 2).

Таблица 2. Динамика клинических симптомов в очагах ограниченной склеродермии в процессе УФА-1 терапии (n=10, медианы и квартили)

Клинический симптом	До УФА-1 терапии	После УФА-1 терапии	p
ИЭ	1,1 (0,7; 1,4)	0,3 (0,1; 0,8)	0,005
ИИ	0,3 (0,1; 1,5)	0,1 (0; 0,8)	0,011
ПИ	21,0 (7,0; 96,0)	16,5 (4,0; 58,0)	0,011

Примечание. ИЭ - интенсивность эритемы (баллы); ИИ - интенсивность индурации (баллы); ПИ - площадь индурации (кв.см).
p - уровень статистической значимости различий при сравнении показателей до и после УФА-1 терапии с использованием теста Вилкоксона.

После курса УФА-1 терапии CD8+ лимфоциты в эпидермисе больных встречались значительно реже (рис. 5), статистический анализ выявил двукратное снижение их содержания после лечения, однако полной нормализации данного показателя не наблюдалось (табл. 3; р<0,001). Экспрессия молекул HLA-DR в эпидермисе значительной динамике под действием лечения не подвергалась.

Таблица 3. Содержание популяций клеток в эпидермисе и периваскулярных инфильтратах кожи здоровых добровольцев и больных ограниченной склеродермией, получавших курс УФА-1 терапии (медианы и квартили)

Популяция клеток	Здоровые добровольцы (n=10)	Больные ограниченной склеродермией (n=10)		p	p1	p2
Популяция клеток	Здоровые добровольцы (n=10)	до лечения	после лечения	p	p1	p2
Эпидермис*
CD8+	0	0,8 (0,6; 1,0)	0,4 (0; 0,8)	<0,001	0,066	0,002
Периваскулярные инфильтраты (%)
CD4+	6,0 (5,0; 8,0)	11,5 (5,0; 18,0)	17,0 (16,0; 18,0)	0,154	0,173	<0,001
CD8+	9,0 (7,0; 13,0)	26,5 (21,0; 30,0)	18,5 (17,0; 20,0)	<0,001	0,022	<0,001
CD4+/CD8+	0,65 (0,60; 0,71)	0,45 (0,19; 0,63)	0,86 (0,69; 0,94)	0,058	0,047	0,069
CD25+	0	31,5 (27,0; 50,0)	17,0 (16,0; 20,0)	<0,001	0,005	<0,001
HLA-DR+	1,8 (1,5; 2,4)	7,1 (4,8; 10,4)	4,9 (3,7; 6,4)	<0,001	0,009	0,001

Примечание. p и p2 - уровень статистической значимости различий при сравнении показателей у здоровых добровольцев и больных соответственно до и после лечения (тест Манна-Уитни). p1 - уровень статистической значимости различий при сравнении показателей у больных до и после лечения (тест Вилкоксона).
* - Количество окрашенных клеток на 100 эпителиоцитов базального слоя.


а	б
Рис.5. CD8+ лимфоциты в эпидермисе и периваскулярных инфильтратах кожи больных ограниченной склеродермией. х400 (а); х200 (б). Здесь и на рис. 6: а — до лечения; б — после курса УФА-1 терапии


а	б
Рис.6. CD25+ клетки в периваскулярных инфильтратах кожи больных ограниченной склеродермией. х400

Проведение УФА-1 терапии не влияло на количество CD4+ лимфоцитов в периваскулярных инфильтратах, но в то же время приводило к статистически значимому уменьшению содержания CD8+ лимфоцитов (р=0,022) и увеличению отношения CD4+/CD8+ лимфоцитов (р=0,047). Тем не менее после лечения в периваскулярных инфильтратах больных оставалось повышенным содержание как CD4+ лимфоцитов, так и CD8+ лимфоцитов (см. табл. 3). Количество CD25+ клеток в периваскулярных инфильтратах кожи после лечения значительно уменьшалось (рис. 6), как и количество HLA-DR+ клеток, но оставалось более высоким, чем в группе здоровых добровольцев.

Следует подчеркнуть, что отмеченные изменения иммунологических показателей у 9 из 10 больных наблюдались на фоне улучшения клинических симптомов заболевания.

Известно, что формирование фиброза в очагах склеродермии сопровождается хроническим воспалением [4,13,14], одним из проявлений которого служит периваскулярная и/или диффузная клеточная инфильтрация кожи. Вместе с тем роль Т-клеточного звена иммунной системы в патогенезе ограниченной склеродермии окончательно не установлена. Известно, что CD4+ и CD8+ субпопуляции лимфоцитов в коже здоровых людей содержатся примерно в одинаковых количествах [15]. Y. Xie и соавт. выявили повышенное содержание в коже больных ограниченной склеродермией CD1a+, CD3+, CD4+, CD8+ и CD57+ клеток, что подтверждает полученные нами данные об увеличении в очагах поражения количества иммунокомпетентных клеток [16].

A.M. Farrell и соавт. обнаружили, что дермальный клеточный инфильтрат в пораженной коже больных склероатрофическим лихеном состоит в основном из CD3+ клеток, 50% из которых составляют CD8+ лимфоциты [2]. Т. Gross и соавт. нашли, что в инфильтратах кожи больных склероатрофическим лихеном CD8+ лимфоциты доминируют, причем большинство этих клеток обнаруживали цитотоксическую активность и экспрессировали маркеры TIA-1 и Granzyme В [5]. Результаты нашего исследования согласуются с данными авторов о доминировании CD8+ лимфоцитов в инфильтратах кожи больных ограниченной склеродермией и важной роли этой субпопуляции в развитии заболевания.

В доступной литературе нам не встретилось публикаций о влиянии УФА-1 терапии на фенотипический профиль лимфоцитов и активность Т-клеточных иммунных реакций в пораженной коже больных ограниченной склеродермией. В нескольких статьях имеются лишь указания на регрессирование в процессе УФА-1 терапии клеточных инфильтратов, выявлявшихся при гистологическом исследовании биоптатов кожи в очагах поражения больных системной и ограниченной склеродермией, а также склероатрофическим лихеном [8, 17-20].

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о важной роли в патогенезе ограниченной склеродермией нарушений Т-клеточного звена иммунной системы, а также о нормализующем влиянии УФА-1 терапии как на субпопуляционный состав лимфоцитов, так и на активность клеточных иммунных процессов в коже больных. Однако для подтверждения полученных результатов необходимо проведение дополнительных, более масштабных исследований.

Выводы

1. В пораженной коже больных ограниченной склеродермией в отличие от здоровых добровольцев обнаружено повышенное содержание основных субпопуляций Т-клеток: CD4+ и CD8+ лимфоцитов с преобладанием супрессорно-цитотоксических лимфоцитов. Увеличенное количество CD4+ лимфоцитов выявлялось только в периваскулярных инфильтратах кожи, тогда как в эпидермисе эти клетки отсутствовали. Содержание CD8+ лимфоцитов было значительно повышено как в периваскулярных инфильтратах, так и в эпидермисе пораженной кожи.
2. В очагах ограниченной склеродермии установлено повышенное содержание клеток, экспрессирующих активированные маркеры CD25 и HLA-DR, что свидетельствует о важной роли в патогенезе заболевания активации Т-клеточного звена иммунной системы.
3. Улучшение клинических симптомов заболевания в процессе УФА-1 терапии сопровождалось снижением активности иммунного воспаления в очагах поражения: частичной элиминацией CD8+ лимфоцитов из эпидермиса и дермы, а также уменьшением количества активированных CD25+ и HLA-DR+ клеток в периваскулярных инфильтратах кожи, однако полной нормализации иммунных нарушений не отмечено.

Литература:

1. Ihn Н., Sato S., Fujimoto М. et al. Demonstration of interleukin 8 in serum samples of patients with localized scleroderma // Arch. Der-matol. 1994. Vol. 130, № 10. P. 1327-1328.
2. Farrell A.M., Marren P., Dean D., Wojnarowska F. Lichen sclerosus: evidence that immunological changes occur at all levels of the skin // Br. J. Dermatol. 1999. Vol. 140. P. 1087-1092.
3. Amento E.P. Immunologic abnormalities in scleroderma // Semin. Cutan. Med. Surg. 1998. Vol. 17, № 1. P. 18-21.
4. Fleishmajer R., Lebwohl M. Scleroderma. Pathogenesis of skin disease. Eds. Thiers B.H., Dobson R.L. / Churchill Livingstone. 1986. Vol. 3. P. 233-247.
5. Gross Т., Wagner A., Ugurel S. et al. Identification of TIA-1+ and Granzyme B+ cytotoxic T cells in lichen sclerosus et atrophicus // Dermatol. 2001. Vol. 202. P. 198-202.
6. Kerscher M., Dirschka Т., Volkenandt M. Treatment of localised scleroderma by UVA, phototherapy//Lancet. 1995. Vol. 346, № 28. P. 1166.
7. Stege H., Berneburg M., Humke S. et al. High-dose UVA, radiation therapy for localized scleroderma // J. Am. Acad. Dermatol. 1997. Vol. 36, № 6 (Pt 1). P. 938-944.
8. Gruss C.J., Kobyletzki G., Behrens-Williams S.C. et al. Effects of low dose ultraviolet A-l phototherapy on morphea // Photoderma tol Photoimmunol Photomed. 2001. Vol. 17. P. 149-155.
9. de Rie M.A., Enomoto D.N.H., de Vries H.J.C., Bos J.D. Evaluation of medium-dose UVA1 phototherapy in localized scleroderma with the cutometer and fast fourier transform method // Dermatology. 2003. Vol. 207. P. 298-301.
10. Scharffetter K., Wlaschek M., Hogg A. et. al. UVA irradiation induces collagenase in human dermal fibroblasts in vitro and in vivo // Arch. Dermatol. Res. 1991. Vol. 283. P. 506-511.
11. Wlaschek M., Heinen G., Poswig A. et al. UVA-induced autocrine stimulation of fibroblast-derived collagenase/MMP-1 by interrelated loops of interleukin-1 and interleukin-6 // Photochem. Photobiol. 1994. Vol. 59, № 5. P. 550-556.
12. Gruss C., Reed J.A., Altmeyer P. et al. Induction of interstitial collagenase (MMP-1) by UVA-1 phototherapy in morphea fibroblasts // Lancet. 1997. Vol. 350. P. 1295-1296.
13. Vierra E., Cunningham B.B. Morphea and localized scleroderma in children // Semin. Cutan. Med. Suig. 1999. Vol. 17, № 3. P. 210-225.
14. Mauch C., Eckes В., Hunzelmann N. et al. Control of fibrosis in systemic scleroderma // J. Invest. Dermatol. 1993. Vol. 100, № 1. P. 92S-96S.
15. Ярилин A.A. Кожа и иммунная система. Косметика и медицина. 2001. №2. С. 5-13.
16. Xie Y., Zhang X., Wakasugi S. et al. Immunohistochemical characterization of the cellular infiltrate in localized scleroderma // lnt J. Dermatol. 2008. Vol. 47. P. 438-442.
17. Kerscher M., Volkenandt M., Gruss C. et al. Low-dose UVA, phototherapy for treatment of localized scleroderma // J. Am. Acad. Der-matol. 1998. Vol. 38, № 1. P. 21-26.
18. Kreuter A., von Kobyletzki G., Happe M. et al. UVAl-Phototherapie bei Lichen sclerosus et atrophicus // Hautartz. 2001. Vol. 52. P. 878-881.
19. Kreuter A., GambichlerT., Avermaete A. etal. Low-dose ultraviolet Al pototherapy for extragenital lichen sclerosus: results of a preliminary study // J. Am. Acad. Dermatol. 2002. Vol. 46. P. 251-255.
20. Kreuter A., Breuckmann F., Uhle A. et al. Low-dose UVA1 phototherapy in systemic sclerosis: effects on acrosclerosis // J. Am. Acad. Dermatol. 2004. Vol. 50. P. 740-747.